Studijní text

1. Osvojte si ovládání fluorescenčního mikroskopu pozorováním názorného vzorku.
   1. Srovnejte okem zobrazení v transmisi a v emisi, diskutujte rozdíly.
   2. Nastavte parametry snímání kamerou, aby barvy a intenzity odpovídaly pozorování okem v okuláru. Uložte snímek vzorku. Popište do protokolu.
2. S použitím sub-difrakčně malých fluorescenčních kuliček změřte bodovou rozptylovou funkci mikroskopu.
   1. Připravte vzorek A, nalezněte kuličky, zobrazte v emisi a transmisi. Diskutujte výhodu fluorescenčního pozorování na tmavém pozadí.
   2. Proměřte 3D prostorovou závislost bodové rozptylové funkce (PSF) určené z emise jednotlivých kuliček. Změřte 11 xy řezů pro vzdálenosti od ohniska (z v oblasti cca -10 m až +10 m).
   3. Měřením vzdálenosti v měřícím programu zkalibrujte obraz (vzdálenost na pixel).
   4. Přímo v praktiku analyzujte pomocí programu ImageJ PSF ve třech rovinách z (z<0, z=0, z>0), vykreslete.
   5. Určete rozlišení Rayleighovým kritériem. Srovnejte s teoretickou hodnotou pro známou emisní délku barviva Nile Red 660 nm a numerickou aperturu použitého objektivu.
3. Použijte mikroskop k měření nanometrových vzdáleností metodou FRET.

O úlohu se student může zajímat až po absolvování nejméně poloviny běžných úloh. Pro stanovení termínu měření a zápis na úlohu je třeba včasná předchozí domluva s vedoucí praktika.

Základní vztahy a klíčová slova:

Fluorescence, rozlišení fluorescenční mikroskopie, difrakční limit, bodová zobrazovací funkce

Pokyny k měření