Studijní text

1. Osvojte si ovládání fluorescenčního mikroskopu pozorováním názorného vzorku.
   1. Srovnejte okem zobrazení v transmisi a v emisi, diskutujte rozdíly.
   2. Nastavte parametry snímání kamerou, aby barvy a intenzity odpovídaly pozorování okem v okuláru. Uložte snímek vzorku. Popište do protokolu.
2. S použitím sub-difrakčně malých fluorescenčních kuliček změřte bodovou rozptylovou funkci mikroskopu, kuličky lokalizujte.
   1. Připravte vzorek A, nalezněte kuličky, zobrazte v emisi a transmisi. Diskutujte výhodu fluorescenčního pozorování na tmavém pozadí.
   2. Proměřte 3D prostorovou závislost bodové rozptylové funkce (PSF) určené z emise jednotlivých kuliček. Změřte cca 7 xy řezů pro vzdálenosti od ostrého obrazu (z v oblasti cca -3 μm až +3 μm).
   3. Měřením vzdálenosti v měřícím programu zkalibrujte obraz (vzdálenost na pixel).
   4. Přímo v praktiku analyzujte pomocí programu ImageJ PSF ve třech rovinách z (z<0, z=0, z>0), vykreslete. Diskutujte symetrii (v xy) a asymetii (v z), vysvětlete.
   5. Určete rozlišení Rayleighovým kritériem. Srovnejte s teoretickou hodnotou pro známou emisní délku barviva Nile Red 660 nm a numerickou aperturu použitého objektivu (viz studijní text).
   6. Proložte PSF vhodnou funkcí maxima a pokuste se některou z kuliček A lokalizovat. Diskutujte přesnost lokalizace.
3. Použijte mikroskop k měření nanometrových vzdáleností metodou FRET.
   1. Nalezněte označené kuličky ve vzorcích B1 a B2.
   2. Uložte obraz fluorescence obou vzorků s dostatečným počtem kuliček dle pokynů.
   3. Určete rozdělení barvy emise kuliček vzorků B1 a B2. Zpracujte graficky formou histogramů pro relativní intenzitu v zeleném a červeném RGB kanálu emise.
   4. Diskutujte výsledná rozdělení. Odpovídá histogram očekávanému počtu vzdáleností barviv Cy3 a Cy5 v měřených vzorcích? Jste schopni rozlišit vzdálenost 4 a 20 bázových párů DNA? Je možné z měření určit účinnost přenosu excitace (za předpokladu E=1 pro 4 bázové páry a E=0 pro vzorek B1), nebo je třeba znát další parametry detekce?
   5. Srovnáním šíře histogramů s křivkou citlivosti na vzdálenost barviv (Obr. 5 studijního textu) odhadněte rozlišení a rozsah měřitelných vzdáleností touto metodou.

O úlohu se student může zajímat až po absolvování nejméně poloviny běžných úloh. Pro stanovení termínu měření a zápis na úlohu je třeba včasná předchozí domluva s vedoucí praktika.

Základní vztahy a klíčová slova:

Fluorescence, rozlišení fluorescenční mikroskopie, difrakční limit, bodová zobrazovací funkce

Pokyny k měření