Rozdíly

Zde můžete vidět rozdíly mezi vybranou verzí a aktuální verzí dané stránky.

--- zadani:335 [27.01.2023 10:27]
Kudrnová Hana Mgr.
+++ zadani:335 [ 3.04.2025 14:58] (aktuální)
Kudrnová Hana Mgr.
@@ Řádek 1: / Řádek 1: @@
 ====== (35) Fluorescenční mikroskop ======
-Pracovní úkoly budou zveřejněny později.
+{{:zadani:texty:txt_335.pdf|Studijní text}}
-**O úlohu se student může zajímat až po absolvování nejméně poloviny běžných úloh.**
+===== Pracovní úkol =====
+  - Osvojte si ovládání fluorescenčního mikroskopu pozorováním názorného vzorku.
+    - Srovnejte okem zobrazení v transmisi a v emisi, diskutujte rozdíly.
+    - Nastavte parametry snímání kamerou, aby barvy a intenzity odpovídaly pozorování okem v okuláru. Uložte snímek vzorku. Popište do protokolu.
+  - S použitím sub-difrakčně malých fluorescenčních kuliček změřte bodovou rozptylovou funkci mikroskopu, kuličky lokalizujte.
+    - Připravte vzorek A, nalezněte kuličky, zobrazte v emisi a transmisi. Diskutujte výhodu fluorescenčního pozorování na tmavém pozadí.
+    - Proměřte 3D prostorovou závislost bodové rozptylové funkce (PSF) určené z emise jednotlivých kuliček. Změřte cca 7 xy řezů pro vzdálenosti od ostrého obrazu (z v oblasti cca -3 μm až +3 μm).
+    - Měřením vzdálenosti v měřícím programu zkalibrujte obraz (vzdálenost na pixel).
+    - Přímo v praktiku analyzujte pomocí programu ImageJ  PSF ve třech rovinách z (z<0, z=0, z>0), vykreslete. Diskutujte symetrii (v xy) a asymetii (v z), vysvětlete.
+    - Určete rozlišení Rayleighovým kritériem. Srovnejte s teoretickou hodnotou pro známou emisní délku barviva Nile Red 660 nm a numerickou aperturu použitého objektivu (viz studijní text).
+    - Proložte PSF vhodnou funkcí maxima a pokuste se některou z kuliček A lokalizovat. Diskutujte přesnost lokalizace.
+  - Použijte mikroskop k měření nanometrových vzdáleností metodou FRET.
+    - Nalezněte označené kuličky ve vzorcích B1 a B2.
+    - Uložte obraz fluorescence obou vzorků s dostatečným počtem kuliček dle pokynů.
+    - Určete rozdělení barvy emise kuliček vzorků B1 a B2. Zpracujte graficky formou histogramů pro relativní intenzitu v zeleném a červeném RGB kanálu emise.
+    - Diskutujte výsledná rozdělení. Odpovídá histogram očekávanému počtu vzdáleností barviv Cy3 a Cy5 v měřených vzorcích? Jste schopni rozlišit vzdálenost 4 a 20 bázových párů DNA? Je možné z měření určit účinnost přenosu excitace (za předpokladu E=1 pro 4 bázové páry a E=0 pro vzorek B1), nebo je třeba znát další parametry detekce?
+    - Srovnáním šíře histogramů s křivkou citlivosti na vzdálenost barviv (Obr. 5 studijního textu) odhadněte rozlišení a rozsah měřitelných vzdáleností touto metodou.
+**O úlohu se student může zajímat až po absolvování nejméně poloviny běžných úloh.**
 Pro stanovení termínu měření a zápis na úlohu je třeba včasná **předchozí domluva s vedoucí praktika**.
+**Základní vztahy a~klíčová slova:**
+Fluorescence, rozlišení fluorescenční mikroskopie, difrakční limit, bodová zobrazovací funkce
+**{{:zadani:pokyny:mereni_335.pdf|Pokyny k měření}}**

Základní fyzikální praktikum

Uživatelské nástroje

Nástroje pro tento web

Rozdíly

Nástroje pro stránku