... vše o fyzikálním praktiku najdete právě na těchto stránkách
UK • MFF • KVOF
Zde můžete vidět rozdíly mezi vybranou verzí a aktuální verzí dané stránky.
Obě strany předchozí revize Předchozí verze Následující verze | Předchozí verze Následující verze Obě strany příští revize | ||
zadani:335 [12.01.2024 10:34] Kudrnová Hana Mgr. |
zadani:335 [12.01.2024 10:42] Kudrnová Hana Mgr. |
||
---|---|---|---|
Řádek 1: | Řádek 1: | ||
====== (35) Fluorescenční mikroskop ====== | ====== (35) Fluorescenční mikroskop ====== | ||
+ | {{:zadani:texty:txt_335.pdf|Studijní text}} | ||
===== Pracovní úkol ===== | ===== Pracovní úkol ===== | ||
Řádek 9: | Řádek 9: | ||
- Srovnejte okem zobrazení v transmisi a v emisi, diskutujte rozdíly. | - Srovnejte okem zobrazení v transmisi a v emisi, diskutujte rozdíly. | ||
- Nastavte parametry snímání kamerou, aby barvy a intenzity odpovídaly pozorování okem v okuláru. Uložte snímek vzorku. Popište do protokolu. | - Nastavte parametry snímání kamerou, aby barvy a intenzity odpovídaly pozorování okem v okuláru. Uložte snímek vzorku. Popište do protokolu. | ||
- | + | - S použitím sub-difrakčně malých fluorescenčních kuliček změřte bodovou rozptylovou funkci mikroskopu. | |
- | **O úlohu se student může zajímat až po absolvování nejméně poloviny běžných úloh.** | + | - Připravte vzorek A, nalezněte kuličky, zobrazte v emisi a transmisi. Diskutujte výhodu fluorescenčního pozorování na tmavém pozadí. |
+ | - Proměřte 3D prostorovou závislost bodové rozptylové funkce (PSF) určené z emise jednotlivých kuliček. Změřte 11 xy řezů pro vzdálenosti od ohniska (z v oblasti cca -10 mikrom až +10 mikrom). | ||
+ | - Měřením vzdálenosti v měřícím programu zkalibrujte obraz (vzdálenost na pixel). | ||
+ | - Přímo v praktiku analyzujte pomocí programu ImageJ PSF ve třech rovinách z (z<0, z=0, z>0), vykreslete. | ||
+ | - Určete rozlišení Rayleighovým kritériem. Srovnejte s teoretickou hodnotou pro známou emisní délku barviva Nile Red 660 nm a numerickou aperturu použitého objektivu. | ||
+ | - Použijte mikroskop k měření nanometrových vzdáleností metodou FRET. | ||
+ | - Připravte vzorky kuliček B1, B2 dle pokynů. | ||
+ | - Uložte obraz fluorescence obou vzorků s dostatečným počtem kuliček dle pokynů. | ||
+ | - Určete rozdělení barvy emise kuliček vzorků B1 a B2. Zpracujte formou histogramu pro relativní intenzitu v zeleném a červeném RGB kanálu emise. Zpracujte výsledky graficky. | ||
+ | - Diskutujte výsledná rozdělení. Odpovídá histogram očekávanému počtu vzdáleností barviv Cy3 a Cy5 v měřených vzorcích? Jste schopni rozlišit vzdálenost 4 a 20 bázových párů DNA? Je možné z měření určit účinnost přenosu excitace (za předpokladu E=1 pro 4 bázové páry a E=0 pro vzorek B1), nebo je třeba znát další parametry detekce? | ||
+ | - Srovnáním šíře histogramů s křivkou citlivosti na vzdálenost barviv (Obr. 5 studijního textu) odhadněte rozlišení a rozsah měřitelných vzdáleností touto metodou. | ||
+ | |||
+ | **O úlohu se student může zajímat až po absolvování nejméně poloviny běžných úloh.** | ||
Pro stanovení termínu měření a zápis na úlohu je třeba včasná **předchozí domluva s vedoucí praktika**. | Pro stanovení termínu měření a zápis na úlohu je třeba včasná **předchozí domluva s vedoucí praktika**. | ||
**Základní vztahy a~klíčová slova:** | **Základní vztahy a~klíčová slova:** | ||
- | Fotometrické a radiometrické veličiny, svítivost a zářivost, světelný a zářivý tok, intenzita vyzařování a spektrální intenzita vyzařování, osvětlení, jas, světelné zdroje anizotropní, izotropní, Lambertův zákon, kosinový zářič | + | Fluorescence, rozlišení fluorescenční mikroskopie, difrakční limit, bodová zobrazovací funkce |
**{{:zadani:pokyny:mereni_335.pdf|Pokyny k měření}}** | **{{:zadani:pokyny:mereni_335.pdf|Pokyny k měření}}** | ||