4.2 Mikroskop

Pro pozorování velmi malých objektů je možné zvýšit zvětšení, když k lupě přidáme ještě jednu čočku. Vznikne tak nejjednodušší mikroskop, který je sestaven ze dvou spojných čoček. První čočka, objektiv, má malou ohniskovou vzdálenost, okulár je tvořen lupou. Optické uspořádání mikroskopu je znázorněno na obr. 10.12 .

Obr. 10.12 Optické schéma mikroskopu. a) průchod paprsků objektivem a okulárem, b) poloha ohniskových bodů objektivu a okuláru.

Předmět je umístěn před ohniskovým bodem objektivu, který vytváří reálný (převrácený) obraz. Ten je pozorován okulárem jako lupou. Pokud je mikroskop zaostřen (tj. je vhodně nastavena vzdálenost mezi okulárem a objektivem), je prvotní obraz vytvořený objektivem v ohniskové rovině okuláru, což znamená, že do oka vstupují rovnoběžné paprsky (oko je neakomodované). Pro zvětšení lupy za těchto podmínek platí vztah (10.127). Příčné zvětšení při zobrazení objektivem je dáno obecným vztahem (10.78), ovšem pro zmíněné nastavení je

, kde

je optický interval soustavy dvou čoček, které tvoří mikroskop. Je tedy

(10.129)

Celkové zvětšení, s nímž pozorovatel vidí předmět, je roven součinu obou zvětšení (10.127), (10.129)

(10.130)

Kromě zvětšení je ovšem velmi důležitým parametrem rozlišení, tedy schopnost rozlišit malé detaily předmětu. I nejdokonalejší zobrazovací soustava vytváří obraz, který není kopií předmětu, ale je částečně zkreslen. Primárním důvodem jsou konečné rozměry čočky, které vedou k tomu, že ne všechny paprsky vycházející z jednotlivých bodů předmětu dopadnou do jednotlivých bodů obrazu. Z hlediska teorie zpracování obrazu, jak ji stručně diskutujeme v kapitole 9., to znamená, že čočka vybírá jen část prostorového spektra předmětu. Jednoduchý odhad rozlišení optického přístroje můžeme udělat pro případ jedné čočky, která zobrazuje transmisní amplitudovou difrakční mřížku (resp. soustavu rovnoběžných štěrbin). Podle mřížkové rovnice pro kolmý dopad vznikají jednotlivé difrakční řády podle vztahu (8.37), který zde připomínáme

(10.131)

Informace o periodě mřížky a je obsažena v prvním řádu - proto čočka, která bude mít aperturu takovou, že propustí pouze nultý a první difrakční řád vytvoří obraz mřížky se správnou periodou, ovšem detailní průběh transmisní funkce mřížky se nemusí zobrazit: například pro pravoúhlou mřížku se objeví v obraze sinový průběh. Mezní rozlišení čočky, tedy nejmenší vzdálenosti v předmětu, které mohou být v obraze rozlišeny, jsou dány podmínkou, že první difrakční řád směřuje na okraj čočky. Je tedy zřejmé, že čím je čočka větší a čím je předmět k ní blíž, tím je možné rozlišit menší detaily, rozlišení je větší. Pokud se předmět blíží k rovině čočky, blíží se úhel prvního difrakčního maxima

a tomu odpovídá podle (10.131) minimální rozlišitelná vzdálenost

(10.132)

To je základní omezení rozlišení optických zobrazovacích přístrojů; není tedy možné rozlišit detaily menší, než vlnová délka světla, která je použita k pozorování. Uvedené úvahy platí ovšem i pro mikroskop. Jeho rozlišení je možné zvýšit zvětšením úhlu, pod kterým mohou vstupovat paprsky do objektivu

, ale také zmenšením optické délky světla: to lze udělat tak, že se předmětový prostor objektivu naplní kapalinou, která má větší index lomu než vzduch (imerze), pak na pravé straně vztahu (10.131) je

. Rozhodující vliv má tedy součin

, který se nazývá numerickou aperturou objektivu (NA). Základní omezení rozlišení délkou vlny zůstává ovšem v platnosti, což je důvodem k používání jejích malých hodnot, jako například v elektronovém mikroskopu, kde obvykle

. Podrobnější vyšetřování rozlišení mikroskopu ukazuje, že je závislé také na podmínkách osvětlení pozorovaného předmětu, například, jaký je stav koherence použitého světla.

V biologii se často používá skenovací konfokální mikroskop. Jeho optické uspořádání sestává opět ze dvou spojných soustav, ale pracuje jinak něž klasický mikroskop. Bodový zdroj světla se zobrazuje objektivem do roviny vzorku, další spojná soustava zobrazuje dále obraz zdroje na detektor, který je umístěn zpravidla za clonou. Název mikroskopu je odvozen od toho, že jsou obě spojné soustavy jsou fokusovány do jedné roviny vzorku. Obraz vzorku je získán tak, že se vzorek posouvá v rovině kolmé ke směru světla, skenuje, po obrazu zdroje (nebo ve složitějším optickém uspořádání je vzorek skenován obrazem zdroje). Signál z detektoru, který je úměrný propustnosti vzorku v místě obrazu zdroje, je zaznamenáván jako funkce polohy. Mikroskop je možné používat pro studium vzorků s větší tloušťkou a přitom rozlišovat obrazy získané v rovinách "různě hluboko" ve vzorku. Skutečně, díky velmi malé ohniskové vzdálenosti prvního objektivu je intenzita dopadajícího světla velká pouze v jeho ohniskové rovině, paprsky vycházející z jiné roviny téměř neprojdou clonou před detektorem. Tak je možné skenovat vzorek i ve směru jeho tloušťky. V posledních letech se začala používat další varianta skenovacího mikroskopu, skenující optický mikroskop s blízkým polem (anglické zkratky, kterými se tyto mikroskopy nazývají jsou SNOM, nebo NSOM). Světlo je na vzorek přenášeno velmi tenkým optickým vláknem (zpravidla vlákno, jehož konec je vytažen na průměry přibližně 10 nm), přitom vzdálenost mezi koncem vlákna a vzorkem je velmi malá, vzorek je osvětlován v blízkém poli (viz kapitola o difrakci). Skenuje se poloha vlákna nad vzorkem, vzdálenost konce vlákna od povrchu vzorku je udržována složitě na základě monitorování síly mezi vláknem a vzorkem. Svazek světla prošlý vzorkem je fokusován do detektoru. Prostorové rozlišení je v tomto případě dáno průměrem vlákna a není omezeno difrakcí, může být proto >> 10 nm pro světlo z viditelné spektrální oblasti.