====== (35) Fluorescenční mikroskop ======

{{:zadani:texty:txt_335.pdf|Studijní text}}

===== Pracovní úkol =====


  - Osvojte si ovládání fluorescenčního mikroskopu pozorováním názorného vzorku.
    - Srovnejte okem zobrazení v transmisi a v emisi, diskutujte rozdíly.
    - Nastavte parametry snímání kamerou, aby barvy a intenzity odpovídaly pozorování okem v okuláru. Uložte snímek vzorku. Popište do protokolu.
  - S použitím sub-difrakčně malých fluorescenčních kuliček změřte bodovou rozptylovou funkci mikroskopu.
    - Připravte vzorek A, nalezněte kuličky, zobrazte v emisi a transmisi. Diskutujte výhodu fluorescenčního pozorování na tmavém pozadí.
    - Proměřte 3D prostorovou závislost bodové rozptylové funkce (PSF) určené z emise jednotlivých kuliček. Změřte 11 xy řezů pro vzdálenosti od ohniska (z v oblasti cca -10 μm až +10 μm).
    - Měřením vzdálenosti v měřícím programu zkalibrujte obraz (vzdálenost na pixel).
    - Přímo v praktiku analyzujte pomocí programu ImageJ  PSF ve třech rovinách z (z<0, z=0, z>0), vykreslete.
    - Určete rozlišení Rayleighovým kritériem. Srovnejte s teoretickou hodnotou pro známou emisní délku barviva Nile Red 660 nm a numerickou aperturu použitého objektivu.
  - Použijte mikroskop k měření nanometrových vzdáleností metodou FRET.
    - Připravte vzorky kuliček B1, B2 dle pokynů.
    - Uložte obraz fluorescence obou vzorků s dostatečným počtem kuliček dle pokynů.
    - Určete rozdělení barvy emise kuliček vzorků B1 a B2. Zpracujte formou histogramu pro relativní intenzitu v zeleném a červeném RGB kanálu emise. Zpracujte výsledky graficky.
    - Diskutujte výsledná rozdělení. Odpovídá histogram očekávanému počtu vzdáleností barviv Cy3 a Cy5 v měřených vzorcích? Jste schopni rozlišit vzdálenost 4 a 20 bázových párů DNA? Je možné z měření určit účinnost přenosu excitace (za předpokladu E=1 pro 4 bázové páry a E=0 pro vzorek B1), nebo je třeba znát další parametry detekce?
    - Srovnáním šíře histogramů s křivkou citlivosti na vzdálenost barviv (Obr. 5 studijního textu) odhadněte rozlišení a rozsah měřitelných vzdáleností touto metodou.


**O úlohu se student může zajímat až po absolvování nejméně poloviny běžných úloh.** 
Pro stanovení termínu měření a zápis na úlohu je třeba včasná **předchozí domluva s vedoucí praktika**.

**Základní vztahy a~klíčová slova:**

Fluorescence, rozlišení fluorescenční mikroskopie, difrakční limit, bodová zobrazovací funkce

**{{:zadani:pokyny:mereni_335.pdf|Pokyny k měření}}**